Μεταφορά σε κυτταρική καλλιέργεια: Βασικός μεταφορέας σιδήρου για συστήματα χωρίς ορό

I. Δομή της τρανσφερρίνης (TF)

Το TF περιέχει 679 υπολείμματα αμινοξέων, με μοριακό βάρος περίπου 79 kDa και ισοηλεκτρικό σημείο περίπου 6,6. Η αλληλουχία αμινοξέων του περιλαμβάνει 38 υπολείμματα κυστεΐνης ικανά να σχηματίσουν 19 ζεύγη δισουλφιδικών δεσμών, τα οποία είναι κρίσιμα για τη σταθεροποίηση της δομής της πρωτεΐνης και διαθέτει τρεις θέσεις Ν-γλυκοζυλίωσης. Το TF αποτελείται από δύο δομικά παρόμοια πεδία δέσμευσης σιδήρου: μια αμινοτελική περιοχή (336 aa) και μια C-τερματική σφαιρική περιοχή (343 aa). Οι δύο τομείς συνδέονται με μια σύντομη αλληλουχία διαχωριστή.

Κάθε θέση δέσμευσης Fe3+ στους τομείς περιέχει τέσσερα διατηρημένα αμινοξέα, συμπεριλαμβανομένων δύο τυροσινών, ενός ασπαρτικού οξέος και μιας ιστιδίνης, και αυτά τα υπολείμματα είναι διατεταγμένα σε μια οκταεδρική γεωμετρία. Επιπλέον, δύο άτομα οξυγόνου που παρέχονται από ανθρακικά ιόντα απαιτούνται στις θέσεις δέσμευσης Fe3+ για τη σταθεροποίηση των ατόμων σιδήρου. Κοντά στις θέσεις δέσμευσης TF, τα Gly-65, Glu-83, Tyr-85, Arg-124, Lys-206, Ser-248 και Lys-296 παίζουν βασικό ρόλο στην απελευθέρωση σιδήρου. Το φαινόμενο πρωτονίωσης του ζεύγους βάσεων Lys-206-Lys-296 που βρίσκεται στην περιοχή απέναντι από το Ν-άκρο μπορεί να προκαλέσει την ανοιχτή ή κλειστή διαμόρφωση του TF.

II. Λειτουργίες της τρανσφερρίνης (TF)

Ο σίδηρος είναι ένα από τα απαραίτητα στοιχεία για τη διατήρηση της κυτταρικής ανάπτυξης, του πολλαπλασιασμού και των μεταβολικών δραστηριοτήτων. Το μεγαλύτερο μέρος του ελεύθερου σιδήρου στο σώμα μεταφέρεται και παρέχεται μέσω της τρανσφερρίνης. Η τρανσφερρίνη (TF), η κύρια β-σφαιρίνη που δεσμεύει και μεταφέρει σίδηρο στο πλάσμα, είναι κυρίως υπεύθυνη για τη μεταφορά του σιδήρου που απορροφάται από τη γαστρεντερική οδό και του σιδήρου που απελευθερώνεται από την αποικοδόμηση των ερυθροκυττάρων. Στον ανθρώπινο ορό, η συγκέντρωση του TF είναι περίπου 2,5 g/L, το 30% του οποίου είναι καταλαμβανόμενο από σίδηρο. Η TF υπάρχει κυρίως σε τρεις μορφές: ολο-τρανσφερρίνη (holo-TF), μερικώς κορεσμένη τρανσφερρίνη (sidero-TF) και απο-τρανσφερρίνη (apo-TF).

Στο εξωκυτταρικό διαμέρισμα (pH ≈ 7,5), ο υποδοχέας τρανσφερρίνης (TFR) έχει υψηλότερη συγγένεια δέσμευσης για το δεσμευμένο με σίδηρο TF (holo-TF) από ό,τι για την ελεύθερη σιδήρου μορφή (apo-TF). Ως αποτέλεσμα, ο δεσμευμένος με σίδηρο TF στη συνέχεια εσωτερικεύεται, ενώ ο apo-TF απελευθερώνεται στην επιφάνεια του κυττάρου. Στα ενδοσώματα (pH ≈ 5,6), ο TFR δεσμεύεται κατά προτίμηση με το apo-TF έναντι του holo-TF, μεσολαβώντας στη μεταφορά του apo-TF από τα ενδοσώματα πίσω στην πλασματική μεμβράνη. Μέσω αυτής της διαδικασίας, ο σίδηρος παρέχεται στα κύτταρα και το TF ανακυκλώνεται.

Ο σίδηρος είναι κρίσιμος για την in-vitro κυτταρική καλλιέργεια. Ως συμπαράγοντας διαφόρων ενζύμων, η τρανσφερίνη συμμετέχει σε πολλαπλές κυτταρικές φυσιολογικές λειτουργίες, τρεις βασικές πτυχές των οποίων περιγράφονται παρακάτω:

1. Συμμετοχή στον κυτταρικό αναπνευστικό μεταβολισμό
Τα μιτοχόνδρια είναι η θέση του κυτταρικού οξειδωτικού μεταβολισμού και το ενεργειακό κέντρο των κυττάρων. Η ηλεκτρική αφυδρογονάση στη μιτοχονδριακή μεμβράνη παίζει ζωτικό ρόλο σε αυτή τη διαδικασία. Ως συστατικό της ηλεκτρικής αφυδρογονάσης, ο σίδηρος εμπλέκεται στον κυτταρικό οξειδωτικό μεταβολισμό και την παραγωγή ενέργειας.

2. Προστασία των κυττάρων από οξειδωτική βλάβη
Ως πυρήνας της δομής σιδήρου-πορφυρίνης, ο σίδηρος είναι βασικό συστατικό ενζύμων όπως η καταλάση και η υπεροξειδάση. Εξαλείφει την τοξικότητα του υπεροξειδίου του υδρογόνου, των φαινολών, των αμινών και των αλδεΰδων, προστατεύοντας τα κύτταρα από βλάβες που προκαλούνται από υπεροξείδια συμπεριλαμβανομένου του H2O2. Παρέχει αντιοξειδωτική άμυνα στα κύτταρα και βελτιώνει την κυτταρική υγεία.

3. Βελτίωση της κυτταρικής πυκνότητας και βιωσιμότητας
Ο σίδηρος είναι απαραίτητο στοιχείο για τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων. Χωρίς σίδηρο, τα κύτταρα δεν μπορούν να προχωρήσουν από τη φάση G1 στη φάση S κατά τη διάρκεια του πολλαπλασιασμού και η έλλειψη σιδήρου προκαλεί κυτταρική απόπτωση και θάνατο. Η ανεπάρκεια σιδήρου βλάπτει τη σύνθεση του DNA κατά τη διάρκεια της κυτταρικής αντιγραφής, επειδή ο σίδηρος είναι συστατικό της αναγωγάσης του ριβονουκλεοτιδίου — του ενζύμου περιορισμού του ρυθμού που καταλύει τη μετατροπή των ριβονουκλεοτιδίων σε δεοξυριβονουκλεοτίδια στη σύνθεση του DNA.

III. Εφαρμογές της τρανσφερρίνης σε καλλιέργεια χωρίς ορό

Η τρανσφερρίνη (TF) είναι ένα απαραίτητο συστατικό στην κυτταρική καλλιέργεια. Ειδικά σε μέσα χωρίς ορό (SFM), η TF έχει εφαρμοστεί ευρέως σε μεγάλη κλίμακα στη βιοκατασκευή, όπως η παραγωγή μονοκλωνικών αντισωμάτων, η σύνθεση ανασυνδυασμένων πρωτεϊνών, καθώς και η καλλιέργεια ανοσοκυττάρων και βλαστοκυττάρων.

1.Ενίσχυση της κυτταρικής ανάπτυξης και απόδοσης προϊόντος
Η συμπλήρωση TF σε μέσα χωρίς ορό (SFM) υποστηρίζει καλλιέργεια υψηλής πυκνότητας κυττάρων CHO, παρατείνει τους κύκλους παραγωγής και ενισχύει τις αποδόσεις πρωτεΐνης.
Η προσθήκη TF σε μέσα χωρίς ορό για κύτταρα υβριδώματος βελτιώνει τον ρυθμό πολλαπλασιασμού και τη βιωσιμότητα των κυττάρων.
Ρυθμίζοντας την ομοιόσταση του σιδήρου, η τρανσφερίνη μειώνει την ετερογένεια των πρωτεϊνικών γλυκομορφών και διασφαλίζει τη συνοχή των φαρμακευτικών προϊόντων από παρτίδα σε παρτίδα.
Όταν εφαρμόζεται σε καλλιέργεια χωρίς ορό κυττάρων CAR-T, NK κυττάρων και μεσεγχυματικών βλαστοκυττάρων (MSCs), η TF διατηρεί τη βιωσιμότητα των κυττάρων και τα λειτουργικά χαρακτηριστικά.

2. Απλοποίηση και Τυποποίηση Διατύπωσης
Ως βασικό συστατικό των συμπληρωμάτων, συμπεριλαμβανομένων των ITS (ινσουλίνη-τρανσφερρίνη-σελήνιο) και SPIT/SPITE, το TF μπορεί να υποκαταστήσει τον ορό για να επιτύχει σκευάσματα χωρίς ζώα, καθορισμένα χημικά και να μειώσει τις παραλλαγές από παρτίδα σε παρτίδα.

3.Υποκατάσταση Χημικών Χηλικών
Οι χημικοί χηλικοί παράγοντες (π.χ. EDTA, κιτρικά) είναι δύσκολο να ρυθμίσουν τους κύκλους οξειδοαναγωγής και είναι επιρρεπείς στην παραγωγή ελεύθερων ριζών. Το πλεονέκτημα της δέσμευσης σιδήρου από το TF είναι ότι βασίζεται σε φυσικές οδούς με τη μεσολάβηση των υποδοχέων χωρίς να παράγει υποπροϊόντα ελεύθερων ριζών.

Η Beijing Anrate Biotechnology Co., Ltd. παρέχει βιομηχανικά παραγόμενη, χωρίς ζώα, ανασυνδυασμένη ανθρώπινη τρανσφερρίνη που προέρχεται από κύτταρα ζυμομύκητα και CHO. Οι έρευνες και οι δοκιμαστικές δοκιμές είναι ευπρόσδεκτες.

Σημαντική Σημείωση