Трансферрин в клеточной культуре: ключевой железоноситель для систем без сыворотки

I. Структура трансферрина (ТФ).

ТФ содержит 679 аминокислотных остатков с молекулярной массой около 79 кДа и изоэлектрической точкой около 6,6. Его аминокислотная последовательность включает 38 остатков цистеина, способных образовывать 19 пар дисульфидных связей, имеющих решающее значение для стабилизации структуры белка, и обладает тремя сайтами N-гликозилирования. ТФ состоит из двух структурно сходных железосвязывающих доменов: N-концевого домена (336 а.о.) и С-концевого глобулярного домена (343 а.к.). Два домена соединены короткой спейсерной последовательностью.

Каждый сайт связывания Fe3⁺ в доменах содержит четыре консервативные аминокислоты, включая два тирозина, одну аспарагиновую кислоту и один гистидин, и эти остатки расположены в октаэдрической геометрии. Кроме того, для стабилизации атомов железа в местах связывания Fe³⁺ необходимы два атома кислорода, обеспечиваемые ионами карбоната. Рядом с сайтами связывания TF Gly-65, Glu-83, Tyr-85, Arg-124, Lys-206, Ser-248 и Lys-296 играют ключевую роль в высвобождении железа. Эффект протонирования пары оснований Lys-206-Lys-296, расположенной в домене, противоположном N-концу, может индуцировать открытую или закрытую конформацию ТФ.

II. Функции трансферрина (ТФ)

Железо является одним из важнейших элементов для поддержания роста, пролиферации и метаболической активности клеток. Большая часть свободного железа в организме транспортируется и доставляется трансферрином. Трансферрин (ТФ), основной железосвязывающий и транспортирующий железо β-глобулин в плазме, в первую очередь отвечает за перенос железа, абсорбируемого из желудочно-кишечного тракта, и железа, высвобождаемого в результате деградации эритроцитов. В сыворотке человека концентрация ТФ составляет примерно 2,5 г/л, 30% из которых занято железом. ТФ в основном существует в трех формах: голо-трансферрин (голо-ТФ), частично насыщенный трансферрин (сидеро-ТФ) и апо-трансферрин (апо-ТФ).

Во внеклеточном компартменте (pH ≈ 7,5) рецептор трансферрина (TFR) имеет более высокую аффинность связывания с железосвязанным ТФ (голо-ТФ), чем с безжелезной формой (апо-ТФ). В результате связанный с железом ТФ впоследствии интернализуется, тогда как апо-ТФ высвобождается на поверхности клетки. В эндосомах (pH ≈ 5,6) TFR преимущественно связывается с апо-ТФ, а не с голо-ТФ, опосредуя транспорт апо-ТФ из эндосом обратно к плазматической мембране. Благодаря этому процессу железо доставляется в клетки, а ТФ перерабатывается.

Железо имеет решающее значение для культуры клеток in vitro. Как кофактор различных ферментов, трансферрин участвует во многих клеточных физиологических функциях, три ключевых аспекта которых описаны ниже:

1. Участие в клеточном респираторном метаболизме.
Митохондрии являются местом клеточного окислительного метаболизма и энергетическим центром клеток. Сукцинатдегидрогеназа на мембране митохондрий играет жизненно важную роль в этом процессе. Как компонент сукцинатдегидрогеназы железо участвует в клеточном окислительном метаболизме и производстве энергии.

2. Защита клеток от окислительного повреждения.
Являясь ядром железо-порфириновой структуры, железо является ключевым компонентом таких ферментов, как каталаза и пероксидаза. Он устраняет токсичность перекиси водорода, фенолов, аминов и альдегидов, защищая клетки от повреждений, вызванных пероксидами, включая H₂O₂. Он обеспечивает антиоксидантную защиту клеток и улучшает их здоровье.

3. Улучшение плотности и жизнеспособности клеток.
Железо является важным элементом для пролиферации клеток. Без железа клетки не могут перейти из фазы G1 в фазу S во время пролиферации, а дефицит железа вызывает клеточный апоптоз и смерть. Дефицит железа ухудшает синтез ДНК во время репликации клеток, поскольку железо является компонентом рибонуклеотидредуктазы — фермента, ограничивающего скорость, который катализирует превращение рибонуклеотидов в дезоксирибонуклеотиды при синтезе ДНК.

III. Применение трансферрина в бессывороточной культуре

Трансферрин (ТФ) является незаменимым компонентом клеточной культуры. ТФ широко применяется в биопроизводстве, особенно в бессывороточных средах (SFM), таких как производство моноклональных антител, синтез рекомбинантных белков, а также культивирование иммунных клеток и стволовых клеток.

1.Усиление роста клеток и выхода продукта.
Добавление TF в бессывороточную среду (SFM) поддерживает культуру клеток CHO с высокой плотностью, продлевает производственные циклы и повышает выход белка.
Добавление ТФ в бессывороточную среду для клеток гибридомы повышает скорость пролиферации и жизнеспособность клеток.
Регулируя гомеостаз железа, трансферрин снижает гетерогенность белковых гликоформ и обеспечивает стабильность фармацевтических препаратов от партии к партии.
При применении к бессывороточной культуре CAR-T-клеток, NK-клеток и мезенхимальных стволовых клеток (МСК) ТФ сохраняет жизнеспособность и функциональные характеристики клеток.

2. Упрощение и стандартизация рецептур.
В качестве основного компонента добавок, включая ITS (инсулин-трансферрин-селен) и SPIT/SPITE, TF может заменить сыворотку для получения рецептур с определенным химическим составом, не содержащих животных, и уменьшения различий между партиями.

3. Замена химических хелаторов.
Химические хелаторы (например, ЭДТА, цитрат) с трудом регулируют окислительно-восстановительные циклы и склонны к образованию свободных радикалов. Преимущество связывания железа с помощью ТФ заключается в том, что оно основано на естественных рецепторно-опосредованных путях без образования побочных продуктов свободных радикалов.

Пекинская биотехнологическая компания Anrate Co., Ltd. поставляет промышленно производимый неживотный рекомбинантный человеческий трансферрин, полученный из дрожжей и клеток CHO. Запросы и пробные тесты приветствуются.

Важное уведомление